Probleemstelling
Digital droplet PCR (ddPCR) is een zeer recente moleculaire techniek die met een hoge precisie, nucleïnezuren detecteert en absoluut kwantificeert. ddPCR kan mutaties opsporen die slechts in lage concentratie voorkomen of een lage expressie vertonen (gevoelig). De techniek is nieuw en moet zijn weg nog vinden in vele, vaak zeldzame, diagnostische toepassingen (o.a. vele zeldzame of moeilijk te detecteren kankergenen). De gouden standaard werkt daar nog vaak met een klassieke (nested) PCR of RT-PCR. De test wordt zowel gebruikt voor diagnose als opvolging.
In dit onderzoek zal een RT-PCR uitgezocht en geoptimaliseerd worden voor de detectie van het zeldzaam (en laag geëxpresseerd) fusiegen FIP1L1-PDGFRA. Dit zeldzaam fusiegen wordt nog gedetecteerd via een klassieke nested PCR. Detectie van dit fusiegen kadert in de diagnose van chronische eosinofiele leukemie. In eerste instantie zal een RT-PCR uitgezocht en opgezet worden. Hiervoor zijn primers en probes beschreven, maar nog niet getest. Hiertoe wordt er nauw samengewerkt met het UZA, centrum moleculaire diagnostiek (dienst hematologie), enerzijds voor het bekomen van DNA en stalen, anderzijds voor de aanlevering van de resultaten voortkomend uit de traditionele (nested) PCR. Data van een controlecellijn (en indien mogelijk deze stalen) zullen gebruikt worden ter optimalisatie van de RT-PCR en om een indicatie te krijgen van de gevoeligheid. Deze RT-PCR kan getransponeerd worden naar ddPCR. Dit gebeurt in samenwerking met de Fontys Hogeschool Eindhoven.
Centrale onderzoeksvraag
Is het mogelijk om een RT-PCR op te stellen voor de detectie van het fusiegen FIP1L1-PDGFRA? Is deze kwantificatie gevoeliger in het ddPCR-systeem?
Methode
Het onderzoek zal volgende gefaseerde aanpak volgen:
- Opkweken van een cellijn die het afwijkend genetisch materiaal heeft
- Conventionele PCR uitvoeren op het genetisch materiaal van deze cellijn (RT-PCR)
- Conventionele PCR omvormen tot digital droplet PCR
- Methodevergelijking wat betreft de gevoeligheid van de conventionele PCR en ddPCR
- In kaart brengen van extra noden aan ddPCR d.m.v. een werkveldbevraging